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    ELISA免疫標(biāo)記技術(shù)實驗原理

    點擊次數(shù):2087  更新時間:2019-04-04

    ELISA免疫標(biāo)記技術(shù)實驗原理

    免疫標(biāo)記技術(shù)是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上,通過這些標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)來顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。常用的標(biāo)記物包括熒光素、酶和放射性核素等,用這3種標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記的免疫檢測技術(shù)被稱為3大免疫標(biāo)記技術(shù)。目前,使用的免疫標(biāo)記物還有化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、鐵蛋白和膠體金等。

    1.原理

    辣根過氧化物酶(HorserADIsh Peroxidase, HRP)

    辣根過氧化物酶 (horse radish peroxidase,簡稱HRP,EC.1.11.1.7)是植物中研究得zui深入的一種過氧化物酶,早在20世紀(jì)30年代就有人著手從辣根中分離此酶,以后又制備出結(jié)晶。本實驗是以辣根為原料,經(jīng)過水的抽提,硫酸銨和丙酮分級分離,再經(jīng)鋅離子純化,透析除鹽,冰凍干燥,便可得到高純度的辣根過氧化物酶。

    辣根過氧化物酶是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì),HRP廣泛分布于植物界,它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白,糖含量18%。HRP由多個同功酶組成,Mr在40000左右,等電點7.2。溶于水,溶解度為5%(W/V),溶液呈棕紅色,透明。酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異,但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下的硫酸銨溶液。HRP可溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液,而0.62飽和度以上則不溶。該酶zui適pH7.0(對愈創(chuàng)木酚為氫給體而言)。在室溫下,HRP幾周內(nèi)穩(wěn)定,加熱到63℃,在15min內(nèi)穩(wěn)定。氧化還原電勢很低,pH6.08時,E 0 =-0.2070V,pH為7.71時,E′0 =-0.2787V。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm,一般以O(shè)D403nm/OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。* ?# p. n2 ~1 w. X3 b

    酶標(biāo)記物包括酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體和酶標(biāo)記SPA等。酶標(biāo)記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否,因此被稱為關(guān)鍵的試劑。酶標(biāo)記物中zui常用的是酶標(biāo)記抗體,它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而成。酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強(qiáng)及親和力高的酶和抗體,其次要有良好的制備方法。目前,高質(zhì)量的酶(如辣根過氧化物酶,簡稱HRP)國內(nèi)已有商品供應(yīng)。高質(zhì)量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上,宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡便易行的方法。

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