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    細胞介導細胞毒作用檢測法

    點擊次數(shù):1066  更新時間:2015-11-16

    (一)原理

        以NK細胞為例。將待測者外周血中的NK細胞與靶細胞(K562細胞)按一定比例混合培養(yǎng)一定時間,NK細胞作用于靶細胞,使靶細胞被殺死、破壞,進而使靶細胞線粒體內的乳酸脫氫酶釋放出來.使底物發(fā)生顏色變化,其顏色深淺與酶的釋放量成正比,檢測顯色后的光密度OD值,便可推算出NK細胞的殺傷活性。

    (二)材料

    1.待檢者肝素抗凝血,靶細胞為K562細胞。

    2.RPMI 1640培養(yǎng)液、淋巴細胞分離液。

    3.酶標儀、離心機。

    (三)方法

    1.用含5%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液將靶細胞調整到5×104~2×105/ml,此濃度需根據(jù)情況預先標定。

    2.取待檢者肝素抗凝血3~5ml,經淋巴細胞分離液分離單個核細胞,為效應細胞。

    3.在96孔圓底細胞培養(yǎng)板中加入靶細胞,每孔加100μl。3個效應細胞自然釋放對照孔不加靶細胞.只加100μl培養(yǎng)液。

    4.向各孔加:100μl效應細胞,效應細胞與靶細胞的比例根據(jù)要求而定,通常為5:l~20:1。自然釋放孔不加效應細胞只加100μl培養(yǎng)液,zui大釋放孔中加100μl1%NP40。每個實驗設3個復孔。

    5.置37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~6h。

    6.離心培養(yǎng)板1000r/min離心10min。每孔吸出150μl上清液.對應加入另一塊96孔酶聯(lián)檢測板中。向第二塊板每孔依次加20μl O.4mol/L乳酸溶液、20ml 4mmol/L 2一p一碘苯酯一3一p一氯化硝基苯四唑,20μl反應液[含O.03%BSA.2.7U/m1硫辛酰胺脫氫酶.4.5mmol/L氫化型輔酶I(NAD+ ),1.2%蔗糖的PBS],室溫中放置20min。

    7.在酶聯(lián)檢測儀上測定各孔的光密度(OD值),檢測波長492nm,參考波長650nm;

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