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    制備SDS-PAGE 凝膠

    點(diǎn)擊次數(shù):1499  更新時間:2015-12-02

    制備SDS-PAGE 凝膠

    (1) 將灌膠玻璃板洗凈,晾干固定,確定灌制分離膠液面標(biāo)志線(距樣品梳子底部約0.5-1.0cm 處)。

    樣品變性及電泳

    (1) 由-80℃冰箱取出提取的組織總蛋白樣品,立即插入冰中(減少蛋白降解)待其融化。

    (2) 根據(jù)蛋白定量結(jié)果,加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與5×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液, 輕輕混合,95℃變性10分鐘,立即插入冰中待用。

    (3) 將樣品輕輕加至凝膠孔中,電泳儀設(shè)置成穩(wěn)壓狀態(tài),接通電源,將電壓調(diào)至80V 使樣品通過濃縮膠與分離膠(電壓約8v/cm)。電泳使染料至分離膠適當(dāng)位置,結(jié)束電泳。

    3.4  凝膠轉(zhuǎn)膜及其檢測

       凝膠電泳結(jié)束后,將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至固相支持物上,然后分別用非標(biāo)記一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗對其進(jìn)行孵育、檢測。用于Western 印跡法的固相支持物有多種,本實驗采用PVDF膜作為固相支持物。本實驗采用濕轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)膜方式。

    (1) PVDF膜的預(yù)處理:先置于100%甲醇中浸泡2-3min,水、電轉(zhuǎn)液依次漂洗2min×2次,置于電轉(zhuǎn)液中備用;

    (2) 剪裁與膠同樣大小的6 層濾紙,用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡后待用。

    (3) 取下電泳板,將其平置(使“凹"面玻璃板在下),小心取出夾板中的墊片及去掉上層玻璃板,切除多余凝膠,將含樣品膠用電轉(zhuǎn)液漂洗一次。ELISA試劑盒

    (4) 將樣品膠與膜裝入標(biāo)有正、負(fù)極的轉(zhuǎn)膜夾板中:由陰極側(cè)開始,依次為海綿墊片→3 層濾紙→樣品膠→PVDF膜→三層濾紙(注意:排除氣泡)→海綿墊片,扣緊轉(zhuǎn)膜夾板,放入含有轉(zhuǎn)膜緩沖液的轉(zhuǎn)移電泳槽中。

    (5) 正確連接轉(zhuǎn)移電泳連線,保證電荷由負(fù)極向正極流動。接通電源,恒壓狀態(tài)下,65v轉(zhuǎn)膜2h(此步操作宜在4℃冰箱中進(jìn)行)。

    (6) 封閉:小心取出轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中,室溫、搖床上緩慢搖動狀態(tài)下封閉1h。

    (7) 一抗反應(yīng):將一抗用封閉液稀釋1000倍;將封閉后的膜直接放入一抗工作液中,4℃反應(yīng)過一個晚上。

    (8) 洗膜:將反應(yīng)膜放入平皿中,用1× TBST 洗滌三次,(室溫下緩慢搖動洗滌)每次10 分鐘,洗凈未結(jié)合的一抗。

    (9) 二抗反應(yīng):將二抗用1×TBST 稀釋3000 倍;將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液中(室溫、避光緩慢搖動)作用60 分鐘。

    (10) 洗膜:用1×TBST 洗膜,方法同(8),洗去游離二抗。

    (11) 曝光及洗片:

    ①按1:1(v/v)混合ECL 試劑盒中兩種液體。

    ②將上述混合液均勻鋪在PVDF膜表面,室溫作用4分鐘。抖掉膜上液體,將其放入鋪有保鮮膜的曝光盒中,再將保鮮膜折疊,以包裹住PVDF膜。

    (12) 曝光完成后將膜用PBST洗10min,用膜再生液洗滌30min,再用PBST洗3×10min,將膜封閉后再加一抗進(jìn)行下一個抗體的檢測。ELISA試劑盒

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